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重組人胱天蛋白酶14蛋白

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6

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電詢

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實驗

重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 一、試劑準(zhǔn)備 1. SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗。 2. 勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。二、蛋白樣品制備 1. 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。（2）每瓶細(xì)胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1 min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）（4）每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行。）（6）于4℃下12000 rpm離心5 min。（提前開離心機預(yù)冷）（7）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存。 2. 組織中總蛋白的提取（1）將少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。（2）加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。（4）裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。 3. 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。? （1）將培養(yǎng)液倒至15 ml離心管中，于2500 rpm離心5 min。（2）棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。（3）用槍洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 三、蛋白含量的測定 1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（1）從－20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。（2）取18個1.5 ml離心管，3個一組，分別標(biāo)記為0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。（3）按下表在各管中加入各種試劑。（4）混勻后，室溫放置2 min。在生物分光光度計（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。 2. 檢測樣品蛋白含量（1）取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測蛋白。（2）取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用無菌水洗一次。（4）取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次。可同時混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間。測得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 四、SDS－PAGE電泳 1. 清洗玻璃板一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。 2. 灌膠與上樣（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）（2）按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。（4）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）（6）測完蛋白含量后，計算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 μl，加樣孔的最大限度可加20 μl樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。（7）加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。 3. 電泳電泳時間一般4～5 h，電壓為40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 五、轉(zhuǎn)膜 1. 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。 2. 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。 3. 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。 4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。） 5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。 6. 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 六、免疫反應(yīng) 1 . 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。 2. 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5 ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。 3. 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 七、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影 1. 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。 2. 在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1 cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為1～2 min（20～25℃），溫度過低時（低于16℃）需適當(dāng)延長顯影時間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為5～10 min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響。重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-14 protein 八、凝膠圖象分析將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。 Recombinant rat Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV 重組大鼠鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IV型 Recombinant human Calpain-1 catalytic subunit 重組人鈣蛋白酶-1催化亞基 Recombinant mouse Calpain-1 catalytic subunit 重組小鼠鈣蛋白酶-1催化亞基 Recombinant human Calpain-2 catalytic subunit 重組人鈣蛋白酶2催化亞基 Recombinant pig Calpain-2 catalytic subunit 重組豬鈣蛋白酶2催化亞基 Recombinant human Calpain small subunit 1 重組人鈣蛋白酶小亞基1 Recombinant human F-actin-capping protein subunit alpha-2 重組人F-肌動蛋白封蓋蛋白亞基的α-2 Recombinant human Caspase-14 protein 重組人胱天蛋白酶14蛋白 Recombinant human Caspase-2 重組人caspase-2 Recombinant human Caspase-5 重組人caspase-5 Recombinant human Extracellular calcium-sensing receptor 重組人細(xì)胞外鈣敏感受體 Recombinant human Calpastatin 重組人鈣蛋白酶抑制蛋白 Recombinant Human Cystathionine beta-synthase 重組人胱硫醚β-內(nèi)合酶 Recombinant Human Cystathionine beta-synthase 重組人胱硫醚β-內(nèi)合酶 Recombinant Human Chromobox protein homolog 7 重組人蛋白Chromobox 7同源 Recombinant human C-C motif chemokine 16 重組人C-C圖案趨化因子16 Recombinant Macaca mulatta Chemokine CCL20/MIP-3ALPHA 重組獼猴趨化因子CCL20 / MIP-3ALPHA Recombinant human C-C motif chemokine 21 重組人C-C圖案趨化因子21 Recombinant Human C-C motif chemokine 25 重組人C-C圖案趨化因子25 Recombinant Human C-C motif chemokine 8 重組人C-C圖案趨化因子8 Recombinant human G1/S-specific cyclin-D1 重組人G1 / S期特異性細(xì)胞周期蛋白D1的 Recombinant human T-complex protein 1 subunit beta 重組人T-復(fù)合蛋白1亞基的β Recombinant human Monocyte differentiation antigen CD14 重組人單核細(xì)胞分化抗原CD14 Recombinant Human Antigen-presenting glycoprotein CD1d 重組人抗原呈遞糖蛋白的CD1d Recombinant human T-cell surface antigen CD2 重組人T細(xì)胞表面抗原CD2 Recombinant Rabbit CD40 ligand 重組兔CD40配體 Recombinant human CD44 antigen 重組人CD44抗原 Recombinant mouse Membrane cofactor protein 重組小鼠膜輔助因子蛋白 Recombinant human CD59 glycoprotein 重組人CD59糖蛋白 Recombinant mouse CD63 antigen 重組鼠CD63抗原 Recombinant mouse Macrosialin 重組小鼠Macrosialin Recombinant human T-cell antigen CD7 重組人T-細(xì)胞抗原CD7 Recombinant mouse H-2 class II histocompatibility antigen gamma chain 重組鼠H-2 II類組織相容性抗原γ鏈 Recombinant rat H-2 class II histocompatibility antigen gamma chain 重組鼠H-2 II類組織相容性抗原γ鏈 Recombinant human CD81 antigen 重組人CD81抗原 Recombinant mouse CD81 antigen 重組鼠CD81抗原 Recombinant mouse CD82 antigen 重組鼠CD82抗原 Recombinant Bovine T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain 重組牛T細(xì)胞表面糖蛋白的CD8α鏈 Recombinant human M-phase inducer phosphatase 3 重組人M相誘導(dǎo)磷酸酶3 Recombinant human Cadherin-1 重組人鈣黏著蛋白-11 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重組人乙酰膽堿受體α亞基 Recombinant mouse Acetylcholine receptor subunit alpha 重組小鼠乙酰膽堿受體α亞基 Recombinant mouse Acetylcholine receptor subunit alpha 重組小鼠乙酰膽堿受體α亞基 Recombinant Torpedo californica Acetylcholine receptor subunit alpha 重組魚丫乙酰膽堿受體α亞基 Recombinant human Probable cytosolic iron-sulfur protein assembly protein CIAO1 重組人可能胞質(zhì)鐵硫蛋白裝配蛋白CIAO1 Recombinant human C-type lectin domain family 18 member A 重組人C型凝集素域家族成員18一 Recombinant mouse Clathrin light chain A 重組小鼠網(wǎng)格蛋白輕鏈 Recombinant Human Clathrin heavy chain 2 重組人網(wǎng)格蛋白重鏈2 Recombinant dog Chymase 重組狗糜蛋白酶 Recombinant mouse Chymase 重組小鼠糜蛋白酶 Recombinant human Cellular nucleic acid-binding protein 重組人細(xì)胞核酸結(jié)合蛋白質(zhì) Recombinant human Calponin-1 重組人鈣調(diào)節(jié)蛋白-1 Recombinant Human Calponin-3 重組人調(diào)寧蛋白-3 Recombinant human Contactin-associated protein 1 重組人Contactin相關(guān)蛋白1 Recombinant human Collagen alpha-1(XI) chain 重組人膠原α-1（XI）鏈 Recombinant Gallus gallus Collagen alpha-1(XII) chain 重組雞內(nèi)金膠原α-1（十二）鏈 Recombinant human Collagen alpha-1(IV) chain 重組人膠原α-1（IV）鏈

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