克倫特羅，為強(qiáng)效選擇性β受體激動(dòng)劑，有強(qiáng)而持久的松弛支氣管平滑肌的作用，用于治療哮喘?？藗愄亓_可促進(jìn)動(dòng)物生長，改善動(dòng)物體內(nèi)脂肪分配，并增加瘦肉率，20世紀(jì)90年代，我國錯(cuò)誤地將其 作為科研成果開始以飼料添加劑引入并推廣，被俗稱為“瘦肉精”。一連串因食用含克倫特羅的食物而引起的中毒事件發(fā)生后，使克倫特羅成了世界上普遍禁用的飼料添加劑1997年以來，我國有關(guān)行政 部門多次明令禁止畜牧行業(yè)生產(chǎn)、銷售和使用鹽酸克倫特羅。但我國各地克倫特羅中毒事件仍然頻繁 發(fā)生，說明非法使用克倫特羅現(xiàn)象依然亨在。為了對畜禽產(chǎn)品中的克倫特羅開展監(jiān)測，加強(qiáng)市場監(jiān)督檢驗(yàn)力度，預(yù)防中毒事件的發(fā)生，必須建立效的檢測方法。

　　我國在這方面的檢測工作起步較晚,伴隨著國際和國內(nèi)對克倫特羅的禁用和監(jiān)控要求，迫切需要發(fā) 展適合我國國情的從篩選到確證的一套檢測方法。為此，本標(biāo)準(zhǔn)提出了從酶聯(lián)免疫法(ELISA)篩選、髙 效液相色譜法(HPLC)定量到氣質(zhì)聯(lián)機(jī)法(GC-MS)確證和定E：這一袞方法來滿足我國動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留監(jiān)控的需要.

　　第一法氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)

　　2原理

　　固體試樣剪碎，用高氣酸溶液勻漿。液體試樣加人高氯酸溶液，迸行超聲加熱提取，用異丙醇+乙 酸乙酯(40 + 60)萃取，冇機(jī)相濃縮，經(jīng)弱陽離子交換柱進(jìn)行分離，用乙醉+濃氨水(98 + 2)溶液洗脫，洗 脫液濃縮，經(jīng)N，0雙三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后于氣質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行測定。以美托洛爾 為內(nèi)標(biāo)，定量。

　　3試劑

　　3-1 克倫特羅(clenbuterol hydrochloride)，純度>99* 5%。

　　3.2 美托洛爾(metoprolol)，純度>99%。

　　3.3磷酸二氫鈉。

       3.4氫氧化鈉。

　　3.5氯化鈉。

　　3.6高氯酸。

　　3.7濃氨水。

　　3.8異丙醇。

　　3.9 乙酸乙酯，

　　3, 10 甲醇：HPLC 級。

　　3.11甲苯：色譜純。

　　3.12乙醇。

　　3, 13衍生劑：N,0-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)。

　　3. 14高氣酸溶液(0.1 mol/U。

　　3. 15氣氧化鈉溶液(1 mol/L)。

　　3. 16 磷酸二氫鈉緩沖液(0.1mol/L，pH = 6.0)。

　　3. 17異丙醇+乙酸乙酯(40 + 60)。

　　3. 18 乙醇+濃氨水(98+2)。

　　3. 19美托洛爾內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取美托洛爾標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醉溶解配成濃度為240 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲 備液，貯于冰箱中，使用時(shí)用甲醇稀釋成2.4 mg/L的內(nèi)標(biāo)使用液0

　　3.20克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配成濃度為250 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備 液，貯于冰箱中，使用時(shí)用甲醇稀釋成0.5 mg/L的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)使用液。

　　3.21弱陽離子交換柱(LC-WCX）（3 mL)。

　　3.22針筒式微孔過濾膜(0.45 μm，水相)。

　　4儀器

　　4.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS）

　　4.2 磨口玻璃離心管:11. 5 cm(長)X3. 5 cm(內(nèi)徑)，具塞。

　　4.3 5 ml玻璃離心管.

　　4.4 超聲波清洗器a

　　4.5  酸度計(jì)。

　　4.6  離心機(jī)。

　　4.7  振蕩器。

　　4. 8  旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

　　4.9   渦漩式混合器。

　　4. 10   恒溫加熱器。

　　4.11 N2-蒸發(fā)器。

　　4. 12勻漿器4 

      5分析步驟

　　5. 1提取

　　5.1.1肌肉、肝臟、腎臟試樣

　　稱取肌肉、肝臟或賢臟試樣10 g(粘確到0.01 g)，用20 mL 0. 1 mol/I.高氣酸溶液勻漿，;^于磨口 玻璃離心管中〖然后晉于超聲波淸洗器中超聲20 min,取出置于80°C水浴中加熱30 min。取出冷卻后 離心(4 500 r/min) 15 min。傾出上済液,沉淀用5 mL 0■ 1 m〇l/L高氣酸溶液洗絡(luò)，再離心，將兩次的 上潔液合并。用〗mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9. 5士0. 1,若冇沉淀產(chǎn)生，洱離心(4 500 r/min) 10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至磨口玻璃離心管中，加人8 g氣化鈉，混勻，加入25 mL異丙醇+乙酸乙酯 (40 + 60)，置于振蕩器上振蕩提取20 min。提取完畢，放置5 min(若冇乳化層稍離心一下)。用吸竚小 心將上層有機(jī)相移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，用20 mL異丙醉+乙酸乙酯(40 + 60)再E犮萃取一次，合并冇機(jī) 相，于60C在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至近干。用1 mL 0. 1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(PH6. 0)充分溶解殘 留物，經(jīng)針筒式微孔過濾膜過濾，洗滌三次后完全轉(zhuǎn)移至5 mL玻璃離心管中，并用0, 1 mol/L磷酸二 氫鈉緩沖液(pH6, 0)定容至刻度。

　　5. 1.2尿液試樣

　　用移液管跫取屎液5 mL，加人20 mL 0. 1 mol/L高氯酸溶液，超聲20 min混勻。置于80°C水浴中 加熱30 min。以下按5, 1. 1從“用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH似至9. 5±0, 1”起開始操作。

　　5. 1.3血液試樣

　　將血液于4 500 r/min離心，用移液管量取上層血淸1 mLS于5 mL玻璃離心管中，加入2 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，混勻，置于超聲波淸洗器中超聲20 min，取出界于80°C水浴中加熱30 min。取出冷 卻后離心(4： 500 r/min)15 min。傾出上淸液，沉淀用1 mLO. 1 mol/LJfJ氣酸溶液洗從，離心(4 500 r/min) 10 min，合并上清液，再重復(fù)一遍洗滌步驟,合并上濟(jì)液。向上淸液中加人約1 g氣化鈉，加人2 ml.舁丙醉 +乙酸乙酯(40+60),在渦漩式混合器上振蕩萃取5 min，放置5 min(若冇乳化層稍離心一下)，小心移出 有機(jī)相于5 mL玻璃離心管中，按以上萃取步驟重復(fù)萃取兩次，合并冇機(jī)相。將冇機(jī)相在N2-濃縮器上吹 干。用1 mL (XI mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)充分溶解殘留物，經(jīng)簡式微孔過濾膜過濾完全轉(zhuǎn)移至 5 mL玻璃離心管中，并用0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)定容至刻度。

　　5.2凈化

　　依次用10mL乙醇、3 mL水、3mL0. 1 mo丨/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)，3 mL水沖洗弱PT1離子 交換柱,取適量5. L 1、5. 1.2和5*1. 3的提取液至弱陽離子交換柱上，棄去流出液，分別用4 mL水和

　　4 mL乙醇沖洗柱子，棄去流出液，用6 mL乙醇+濃氨水(98 + 2)沖洗柱子，收集流出液。將流出液在 N2-蒸發(fā)器上濃縮至干。

　　5_3衍生化

　　于凈化、吹干的試樣殘?jiān)屑尤?00 ML?500 中醉，50 yL 2. 4 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液，在N2-蒸發(fā)

　　器上濃縮至干，迅速加人4〇mL衍生劑(BSTFA),蓋緊塞子，在渦漩式混合器上混勻1 mirug于75T：的 恒溫加熱器中衍生90 min。衍生反應(yīng)完成后取出冷卻至室溫，在渦漩式混合器上混勻30 3,罝于N2-蒸發(fā)器上濃縮至干。加人200 ;xL甲苯，在渦漩式混合器上充分混勻，待氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣。同時(shí)用克倫特 羅標(biāo)準(zhǔn)使用液做系列同步衍生。

　　5,4氣相色譜-質(zhì)譜法測定

　　5.4. 1氣相色譜-質(zhì)譜法測定參數(shù)設(shè)定

　　氣相色譜柱:DIV5MS 柱，30 m X 0• 25 mmXO. 25 pma 載氣:He,柱前psU 進(jìn)樣口溫度：240flC。

　　進(jìn)樣量HU不分流.

　　柱溫程序：70t：保持1 min，以18t：/min速度升至200X：，以StVniin的速度再升至245T：,再以 25T：/min 升至 280X：并保持 2 min。

　　EI源

　　電子轟擊能：70 eV。 •

　　離子源溫度：200t：。

　　接口溫度：2851。

　　溶劑延遲：12 min。

　　£1源檢測特征質(zhì)譜峰:克倫特羅：11^86、187、243、262;美托洛爾：11^72、223。

　　5.4,2測定

　　吸取1 衍生的試樣液或標(biāo)準(zhǔn)液注人氣質(zhì)聯(lián)用儀中，以試樣峰(m/2 86,187,243,262,264,277,

　　333)與內(nèi)標(biāo)峰(m/z 72,223)的相對保留時(shí)間定性，要求試樣峰中至少冇3對選擇離子相對強(qiáng)度(與基峰 的比例)不超過標(biāo)準(zhǔn)相應(yīng)選擇離子相對強(qiáng)度平均坑的士20%或3倍標(biāo)準(zhǔn)差。以試樣峰(m/2 86)與內(nèi)標(biāo) 嶺(mA 72)的峰面積比單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)定量。

　　5,4.3克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)衍生后的選擇性離子的總離子流圖及質(zhì)譜圖

　5.5結(jié)果計(jì)算

　　按內(nèi)標(biāo)法單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)計(jì)炸試樣中克倫特羅的含量。

　　見式(1):

　　6精密度

　　在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過笄術(shù)平均值的20%。

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